DLS与Zeta电位——它们是什么，又不是什么？

Sourav Bhattacharjee

爱尔兰都柏林4区贝尔菲尔德，都柏林大学（UCD）兽医学院

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收稿日期 2016年4月13日 修订稿收到日期 2016年6月8日 接受日期 2016年6月9日 在线发布日期 2016年6月10日

关键词:

DLS Zeta电位 流体动力学半径 表面电位 胶体稳定性 表面电荷

0 摘要

对纳米颗粒（NPs）进行充分的表征对于开发定义明确、具有治疗相关性的纳米制剂至关重要。测定NPs的粒径和表面电荷对于恰当地表征NPs是必不可少的。动态光散射（DLS）和Zeta电位（ZP）测量作为确定粒径和表面电荷的简单、易行且可重复的工具而广受欢迎。然而遗憾的是，在实际应用中，这两种技术存在大量挑战，包括对操作原理的理解不足以及处理诸如样品制备和数据解读等关键问题。由于DLS和ZP均源于物理胶体化学领域，从事纳米医学研究的研究人员很难精通这两种技术。此外，在药物递送研究领域，几乎没有文献对这些技术提供简单、扼要的说明。本综述旨在解决这一问题，同时提供这些技术的基本原理，总结核心数学原理，并为处理DLS和ZP测量中常见问题提供实用指南。最后，本综述试图从转化角度分析这两种技术的相关性。

© 2016 Elsevier B.V. 版权所有。

1. 引言

纳米材料的物理化学性质决定了它们在生物环境中的行为[1,2]。因此，为了获得具有高转化价值的可靠数据，对纳米颗粒（NPs）进行充分的表征至关重要。这一点也与安全问题相关，这些问题通常归因于NPs的物理（例如，粒径[3]、表面电荷[4]、形状[5]）和化学（例如，用不同配体进行的表面功能化，包括PEG化[6]、杂质[7]、结晶度[8]）性质。充分的表征有助于将NPs解释为高反应性的化学物种，与块状材料相比，它们表现出前所未有的特性（例如，电导率[9]、荧光[10]、磁性[11]）。为了拓宽NPs的应用范围，学术界和工业界内已形成一个研究密集型框架，并在过去几年中吸引了大量资金和媒体关注[12]。表面电荷和粒径是两个最常被提及的、导致NPs一系列生物学效应的因素，包括细胞摄取[13]、毒性[14]和溶解[15]。新出现的数据表明，这两个因素影响着为携带药物载荷（例如，大分子[16]、多肽[17]）并旨在靶点部位（例如，用于口服给药的小肠[18]）释放而设计的NPs的释放曲线。在开发纳米颗粒药物递送系统（DDS）期间，研究这两个参数非常重要，尤其是考虑到已知生物基质会通过不同机制（例如，蛋白质吸附导致特征性的蛋白冠[19,20]）改变NPs的这两个特征。

动态光散射（DLS）——也称为光子相关光谱法[21]或准弹性光散射[22]——和Zeta电位（ZP）已成为在普通实验室环境下可执行的简单台式技术，分别用于研究NPs的（流体动力学）尺寸和表面电荷。从胶体化学家专用的技术，DLS和ZP都已发展成为药学界内的常用工具。 集成化、紧凑且价格合理的仪器提供了用户友好的数字界面，并可能进行全面的数据分析。此外，这些技术是无损的，仅需最少的样品制备，且无需实验前校准。现代仪器能够就生成数据的质量为用户提供指导，并可能进行时间依赖性测量，以及能够将数据轨迹导出为与各种绘图软件兼容的文件。

然而遗憾的是，由于频繁使用且缺乏谨慎和适当的培训，纳米医学研究中报告的DLS和ZP数据质量并非总是优秀。纳米颗粒在胶体体系中的分散体表现出双相（分散相和分散介质），随时间不发生沉降[23]，并以颗粒的布朗运动为特征[24]。对于带电NPs，由于表面、分子和离子之间的相互作用导致在NPs上形成吸附层[25]，该体系变得更加复杂。DLS和ZP都利用胶体分散体的这些性质来推导出流体动力学半径（RH\mathrm{R}_{\mathrm{H}}）[26]和在具有电泳迁移能力的颗粒的特征性滑动面上的电位差[27]。在本综述中，我们力求对这两种技术提供一个简单的说明，同时仅引用必要的数学原理，以便理解它们的优缺点。本文将简要讨论不同因素为何以及如何影响这些测量，这些因素共同决定了数据的质量。本综述还尝试提供与药物递送相关的、涉及这些技术实际操作的现实示例。

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2. DLS (动态光散射)

2.1. 背景

2.1.1. 粒径在定义纳米材料中的作用

尺寸是定义纳米颗粒（NPs）的一个重要因素，尽管关于区分NPs与块状材料的尺寸阈值存在相当大的争议。

为了解决这个问题，欧盟（European Union）发布了一项指令（2011/696/EU），其中就如何定义纳米材料提供了具体指导。该文件的一些相关摘录如下： (1) [第8段] “一个确定的尺寸范围将有助于统一解释。下限被提议为1 nm。上限通常根据普遍共识使用100 nm，但没有科学证据支持此值的适当性。使用单一上限可能对纳米材料的分类过于局限，差异化的方法可能更为合适。” (2) [第9段] “国际标准化组织将‘纳米材料’一词定义为‘任何外部尺寸处于纳米尺度或具有纳米尺度内部结构或表面结构的材料’。‘纳米尺度’一词被定义为大约在1 nm到100 nm之间的尺寸范围。” (3) [第11段] “本建议中定义的纳米材料应包含50%或更多尺寸在1 nm-100 nm之间的颗粒。”

除了提供具有法律约束力的纳米材料定义外，该文件还就如何表征它们给出了明确的指导： (4) [第8段] “出于监管目的，还应考虑数量粒径分布，使用平均尺寸和尺寸的标准差来完善定义。材料的粒径分布应以基于数量浓度的粒径分布（即给定尺寸范围内的物体数量除以总物体数量）来呈现，而不是基于纳米材料中纳米尺度颗粒的质量分数，因为小的质量分数可能包含最大数量的颗粒。”

该文件中提出了一些有趣的命题，从这个角度来理解DLS作为一种纳米颗粒尺寸测量工具是恰当的。该文件放宽了被广泛接受的1−100 nm1-100 \mathrm{~nm}的尺寸阈值作为纳米材料的标准，尽管仍然将纳米尺度材料定义为至少有一个外部尺寸≤100 nm\leq 100 \mathrm{~nm}。即使是不同尺寸颗粒的混合物，只要其中≤100 nm\leq 100 \mathrm{~nm}的颗粒（按数量计）<50%，也可以被视为纳米材料。因此，了解混合物中不同颗粒群体的粒径分布现在变得很重要。第三，不仅需要知道精确的粒径分布，现在同样重要的是知道样品中NPs的 数量分布。这些发现在后续章节讨论DLS时将变得重要。

2.1.2. DLS的原理

2.1.2.1

2.1. 颗粒对光的散射。分散的NPs对入射光的散射与其半径的6次方成正比[28]。当颗粒尺寸小于入射光波长的1/10（即λ/10\lambda/10）时，散射光与入射光携带相同的能量（弹性散射），并且与角度无关（瑞利散射）[29]。然而，当颗粒尺寸超过λ/10\lambda/10这个阈值时，瑞利散射被各向异性的米氏散射所取代，其中散射光的能量与入射光不等（非弹性散射）且与角度有关（图1）[30]，散射光在入射光方向上强度最大[31]。这个尺寸阈值（λ/10\lambda/10）是由于电磁波（如光）与颗粒相互作用的方式决定的，超出了本综述的范围，但有优秀的教科书和参考文献可供查阅[32,33]。

2.1.2.2

2.2. 基本数学算符。在DLS中，胶体分散体中的颗粒散射入射激光，散射光的强度被检测到。分散体中不断运动的颗粒引起相长干涉和相消干涉，因此，散射光的强度随时间波动（图2A）[34]。在DLS中，散射光的强度波动与短的衰减间隔（τ\tau）进行关联，从而得到强度自相关函数（ACF）[35]，对于纯单分散颗粒的样品，通过以下单指数方程（图2B）获得（公式（1））：

G(τ)=1+b⋅e−2Dtq2τ\begin{equation*} G(\tau)=1+b \cdot e^{-2 D_{t} q^{2} \tau} \tag{1} \end{equation*}

这里，bb = 取决于仪器和光学设置的常数，DtD_t = 平动扩散系数，qq = 散射矢量，可以进一步表示为（公式（2））：

∣q∣=4πnoλosin⁡θ2\begin{equation*} |q|=\frac{4 \pi n_{o}}{\lambda_{o} \sin \frac{\theta}{2}} \tag{2} \end{equation*}

其中，non_o = 溶剂的折射率（RI），λo\lambda_o = 真空中的波长，θ\theta = 散射角。

强度ACF (G(τ))(G(\tau)) 通常写作G2(τ)G2(\tau)，并表示为场相关函数 G1(τ)G1(\tau) 的函数，如以下公式（3）所述：

G2(τ)=1+G1(τ)2\begin{equation*} G 2(\tau)=1+G 1(\tau)^{2} \tag{3} \end{equation*}

图1. 显示瑞利散射和米氏散射差异的示意图。

图2. (A) DLS测量中由于相长和相消干涉导致的NPs散射光强度的波动。(B) 软件生成的相关图，用于估算RHR_H。结果来自于在25∘C25^{\circ} \mathrm{C}下对分散在水中（100μg/ml100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}）的高度单分散的100 nm羧化乳胶珠（PDI 0.01）进行的DLS测量，使用Malvern NanoZS仪器和塑料比色皿（DTS1070），并由Zetasizer®（版本7.10）软件分析。

在DLS仪器（例如，Malvern Zetasizer®）中，会生成一个相关图，其中绘制了原始相关函数（RCF）（图2B）与延迟时间（τ\tau）的关系，如公式（4）所示： RCF=G2(τ)−1=G1(τ)2R C F=G 2(\tau)-1=G 1(\tau)^{2} 这表明RCF依赖于场相关函数 G1(τ)G1(\tau)。

在DLS中，自相关函数 [G2(τ) 或 G2(τ)−1][G2(\tau) \text{ 或 } G2(\tau)-1] 是通过数据拟合计算的，然后使用公式（1）计算DtD_t。 （4）Dt=kBT6πηRHD_{t}=\frac{k_{B} T}{6 \pi \eta R_{H}} 固体球形颗粒的流体动力学半径（RHR_H）可以通过公式（5）（斯托克斯-爱因斯坦方程）导出：

其中kBk_B = 玻尔兹曼常数（1.38064852×10−23 J/K1.38064852 \times 10^{-23} \mathrm{~J} / \mathrm{K}），TT = 温度，η\eta = 绝对粘度，RHR_H = 流体动力学半径。

图3. NP表面形成的软冠和硬冠示意图。“蛋白质吸附是单个蛋白质和NP特性（如表面修饰、组成和直径）的动力学（k）和热力学（K）函数。最初，高丰度和/或高迁移率的蛋白质与纳米颗粒表面结合。随着时间的推移，这些蛋白质被具有更高结合亲和力的较低迁移率的蛋白质所取代。NP冠中常见的血清蛋白被展示为一个代表性的蛋白冠：血清白蛋白、免疫球蛋白G1（IgG1）、α-2巨球蛋白（A2M）和载脂蛋白A-1（apoA1）。” 图及图注根据ACS开放获取政策从参考文献[44]复制。

所描述的数学方程表明，DLS结果取决于几个变量，包括溶剂粘度[36]、仪器[37]、温度[38]、材料的折射率（RI）[39]等。

2.1.2.3

2.3. 分散在胶体体系中的颗粒。虽然胶体分散体中颗粒的运动是随机和平动的，但颗粒也以非常快的速度旋转[40]。颗粒间的相互作用也很重要，因为随着浓度的增加，颗粒间的碰撞次数增加，而颗粒在连续碰撞之间移动的平均路径长度减少[41]。分散颗粒的表面会根据吸附层而改变。这种现象的一个常见例子是蛋白质在NPs表面的吸附，形成了特征性的蛋白冠[42,43]。分散的颗粒表现出一个水合表面，包裹在一层并非颗粒本身成分的分子外衣中。蛋白冠通常被发现由“硬”和“软”两部分组成（图3）[44]。硬冠指的是紧密结合在颗粒上的内部稳定层[45]。软冠是在硬冠之上相对疏松的层，由不同电荷和大小的分子组成[46]。在胶体体系中，散射光的是由包裹在具有改变成分的水合/溶剂化表面蛋白冠中的NP核心构成的这些结构。因此，在DLS中，被测定的颗粒在组成和表面化学上与最初合成的颗粒不同。

在最近的一项研究中，DLS被成功用于测定PLA（聚乳酸）和PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）NPs在缓冲液、模拟生物体液（唾液、胃液、肠液和溶酶体液）、血清和组织匀浆（小鼠大脑、脾脏、肝脏）中的稳定性[47]。虽然PLA NPs在这种生物相关条件下表现出合理的稳定性，但PMMA NPs不稳定并随时间聚集。这种系统的DLS研究提供了一种体外工具，用于在体内研究之前调查NPs的稳定性。在另一项研究中，Khan等人（2015）[48]有效地使用DLS来研究蛋白质（如HSA（人血清白蛋白）、BSA（牛血清白蛋白）和HB（血红蛋白））在不同尺寸（2−40 nm2-40 \mathrm{~nm}）的CTAB稳定的金纳米颗粒（GNPs）上的吸附。此外，他们将数据与数学模型相关联，以推导吸附动力学和随后在GNPs上蛋白冠的形成。此外，他们还就蛋白质结构和NPs的表面化学如何影响蛋白冠的形成提供了见解。从NPs在体内行为的角度来看，理解蛋白冠在NP表面上生长的动力学是重要的[49]。Salvati等人（2013）已表明，在转铁蛋白功能化的二氧化硅NPs（约50 nm）上生长蛋白冠会消除其受体靶向能力[50]。因此，详细研究以了解不同NPs上蛋白冠的化学性质将增强其转化潜力，而DLS可以与ITC（等温滴定量热法）、FT-IR（傅里叶变换红外光谱）和荧光光谱等技术一起，成为此类研究中的有效工具。

2.1.2.4

2.4. RHR_H (流体动力学半径) 和 RgR_g (回转半径)。RHR_H（流体动力学半径）是假设的硬球体的半径，该球体以与DLS下测定的颗粒相同的速度扩散[51]。因此，RHR_H是一个假设的测量值，因为这样的硬球体在胶体分散体中很少存在。实际上，分散的颗粒是水合/溶剂化的，连同其蛋白冠一起通常不是球形的。蛋白冠的组成——尤其是软冠——是动态的，并随时间根据环境中的离子强度、存在的小分子和大分子类型以及溶剂性质而波动[52,53]。因此，DLS只提供胶体的一个指示性尺寸。RgR_g（回转半径）是从质心到分子（例如蛋白质）或NP内每个原子的质量平均距离。对于表现出瑞利散射的较小NPs，RgR_g通过SAXS（小角X射线散射）测量[54]，而对于表现出各向异性米氏散射的较大颗粒，则使用静态光散射（SLS）

图4. DLS的仪器示意图。

[55]。Rg/RHR_g/R_H比率提供了关于分散颗粒的紧密性和形状的见解（球形NPs约为0.78，线团为1.5-2.1，纳米管>2）[56,57]。

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2.2. DLS的仪器和技术方面

近年来出现了一系列光散射仪器 [例如，Malvern (Zetasizer®系列), Brookhaven (NanoDLS®系列), Microtrac (Wave II®系列)]。Malvern Zetasizer®系列仪器在大学毕业生中广受欢迎，并且是从1970年上市的原始Malvern Correlator®逐渐演变而来。总体而言，这些仪器包含三个主要部件——激光器、样品和光探测器（图4）。

2.2.1. 激光器

Malvern Zetasizers®中使用的激光器是波长为633 nm的4 mW氦氖激光器，但Zetasizer® APS和Zetasizer® µV除外，它们使用的是60 mW的二极管激光器（830 nm）[58]。Malvern还提供其他波长的DLS仪器，例如532 nm（绿色）。NanoDLS®系列配备波长为638 nm的激光器[59]。这些激光源提供稳定的相干单色光束。仪器中还配有衰减器以改变激光功率。

2.2.2. 样品

使用由无划痕玻璃或光学透明的一次性塑料制成的洁净方形比色皿（3×3 mm,5×5 mm3 \times 3 \mathrm{~mm}, 5 \times 5 \mathrm{~mm} 或 10×10 mm10 \times 10 \mathrm{~mm}）。也有内置电极、能够同时进行DLS和ZP测量的塑料比色皿（DTS1070，与Zetasizer® ZS, Z和ZS90兼容）。样品应洁净、均一、透明，无任何沉淀。所需的最小样品体积因型号而异（Zetasizer® S为12μl12 \mu \mathrm{l}，Zetasizer® µV为2μl2 \mu \mathrm{l}）。然而，为了获得高质量的数据，至少应准备1-2 ml的样品。

2.2.3. 探测器

现代DLS仪器配备了雪崩光电二极管（APD）探测器，其在红色波长区域的量子效率约为65%，因此使用633 nm的激光器。在最新的仪器中，探测器放置在173∘173^{\circ}角以检测背向散射，尽管在一些旧型号（Nano S90, ZS90）中，角度仍然是90∘90^{\circ}。将探测器放置在173∘173^{\circ}角可以检测背向散射并排除过量的散射光。这有助于揭示源自较小颗粒的低强度 散射光信号。与90∘90^{\circ}布置相比，这也增加了（约8倍）比色皿内被照亮样品的面积[60]。在这种非侵入式背向散射系统（NIBS）布置中，可使用聚焦透镜，通过选择样品的照亮区域在比色皿的中间（对于稀释样品）或靠近壁面（对于高浓度样品）来改变散射光在到达探测器之前的路径长度。

2.2.4. 操作软件界面

目前的软件（例如，Zetasizer®）通过提供一系列选项，让用户可以设计自定义的标准操作规程（SOPs）。该界面允许用户输入溶剂（例如，溶剂名称、粘度）和材料（例如，RI、吸收）的数据。最新版本中默认包含了最常用分散剂（例如，水、甲苯）和材料（例如，聚苯乙烯、蛋白质）的数据，而在线资源[61]则提供了其他溶剂和材料的详细信息。这些信息在各向异性米氏散射中尤为重要。还需要输入实验条件（例如，温度、平衡时间）。一旦生成，SOPs便可无需修改地用于后续样品。Zetasizer®在主选项卡中显示粒径分布数据，而第二个选项卡显示ACF(G1(π)−1G1(\pi)-1)和随时间变化的波动散射光强度（kcps）。第三个选项卡主要用于指导，系统地列出了所有当前运行的实验并显示数据质量。实验完成后，数据存储在可检索的数据库中。通常，提供按强度、体积和数量分布的z-平均尺寸和粒径分布以及多分散指数（PDI）。粒径分布数据可以以线图或直方图的形式提供，并可以通过从Malvern在线资源免费下载的软件导出。

2.2.5. 数据拟合算法和分析

在DLS中，散射光的ACF通过两种不同的数学算法进行拟合： a) 在累积量法中，ACF的初始部分（最多10%）被拟合成一个单指数衰减，其中第一和第二累积项分别提供z-平均尺寸和PDI [62]。因此，z-平均尺寸总是为每个样品提供一个单一值。累积量法比其他算法更不易受噪声影响。然而，它不适用于非均相的多分散样品，在某些情况下可能会产生误导（补充材料1）。 b) 对于累积量拟合不适用的多分散和非均相样品，首选CONTIN算法[63]。在这里，相关函数在更长的时间段内进行拟合，并为每个峰提供粒径分布分析以及平均尺寸和宽度。

对于完全单分散的样品，这两种算法应产生相同的结果。然而，实际上样品很少是单分散的，因此通过这两种算法得到的结果会有所不同。DLS的PDI通常描述了不同尺寸颗粒组分散射的光的强度，并通过(宽度/平均值)²计算每个峰的PDI。PDI≤0.1被认为是高度单分散的，而0.1-0.4和>0.4的值分别被认为是中度和高度多分散的。

2.3. 影响DLS结果的因素

2.3.1. 样品制备

样品制备在DLS测量中至关重要。样品可以在溶剂（例如，水、甲醇、乙醇、甲苯）[64]或稀释剂（例如，10%甲醇水溶液）[65]中制备。一些溶剂（例如，甲苯）会散射光[66]，这会作为背景噪声产生干扰，而一些溶剂 （例如，DMSO）的粘度会随温度变化而显著改变[67]。用于DLS测量的样品应清澈、均一且无混浊。检查比色皿底部是否有沉淀是很有用的。任何沉淀都证实了较大颗粒的存在，这可能是由于分散不良、pH值错误、超声处理不充分造成的，并会影响实验结果。通常不建议使用去离子水（DI water），因为离子的缺失无法屏蔽颗粒间的长程相互作用。因此，在去离子水中得到的尺寸总是比实际尺寸大2-10 nm[68]。在少数情况下（例如，PEC），使用稀盐水可以得到更好的数据，因为离子可以屏蔽颗粒间的长程相互作用。使用10 mM KNO3\mathrm{KNO}_{3}比NaCl更好，因为氯离子反应性很强。过滤样品以去除灰尘颗粒或团块是有帮助的，尽管可能会产生人为的窄粒径分布。可以使用孔径比样品中预期最大颗粒大三倍（例如，5 µm）的、经过适当清洗的滤膜。密度低的大颗粒可能会漂浮在溶剂层顶部（乳析）[69]，这会使DLS失效。对于粉末制剂（例如，冻干产品），剧烈搅拌可以溶解NPs。超声处理需要谨慎，尤其是在涉及蛋白质时。对于聚合物NPs，可能需要长达24小时的超声处理才能获得稳定且均一的分散体。

2.3.2. 样品浓度

较高浓度的NPs会导致多重散射，即一个颗粒的散射光在到达探测器之前与其它颗粒相互作用并损失强度[70]。结果是得到的尺寸被人为地减小了。除非使用表面活性剂，否则在高浓度下会发生不可预测的团聚[71]。相反，使用过于稀释的样品可能无法产生足够用于分析的散射光。因此，找到最佳样品浓度至关重要。很难为DLS的理想浓度提供一个通用指南，因为它会变化并取决于与仪器（例如，散射体积、散射角、激光功率、探测器灵敏度）[72]和颗粒的材料性质（例如，分子量、紧密性）[73]相关的因素。例如，球形且更紧密的NPs比不那么紧密的NPs散射更多的光[74]。Malvern Zetasizer®手册指出，实验期间至少应检测到一百万（10610^6）个残余光子，才能获得高质量且高信噪比（S/N）的数据，其中残余光子指样品和溶剂散射光子数的差值。Brookhaven Instruments的用户手册建议样品浓度应能产生最高达600 kcps的计数，尽管对于大多数样品，500-600 kcps的计数效果良好。DLS实验中的噪声与所计数光子数的平方根成反比，因此，要实现良好的信噪比，需要一个最低的光子计数阈值。在实践中，可能需要对系列稀释液进行DLS实验以确定最佳浓度。

2.3.3. 有色和荧光样品

理想情况下，DLS应避免使用有色和荧光样品[75]。荧光NPs的使用有所增加，因为它们常与显微镜技术结合使用。进行对照实验以排除荧光团在激光波长下吸收光的可能性是至关重要的。如果发生吸收，散射光的强度会降低，因此会估算出人为较小的颗粒尺寸[76]。荧光是非相干的，并被记录为噪声。APD探测器通常无法区分各种强度。因此，在存在荧光的情况下，可能会出现 повышенный噪声，这会恶化信噪比，导致数据质量低下和峰展宽。不幸的是，许多常用的荧光团在600-700 nm范围内吸收和发射，这会干扰DLS。为了最大限度地减少这种干扰，一些仪器中装有窄带滤光片，以滤除与激光波长不同的波长 （例如，633±2.5 nm633 \pm 2.5 \mathrm{~nm}）。然而，这也会减少探测到的光子数量，因此可能需要更高的浓度。

2.3.4. 团聚的影响

NPs有团聚的趋势[77]，虽然其中一些团聚是可逆的，但通常并非如此。因此，常使用不同的表面活性剂来制备稳定的分散体[78]。从含有团聚NPs的分散体中获得高质量数据是困难的，因为较大的团聚块会散射过多的光，这可能会损坏探测器。过度的散射还会掩盖来自较小颗粒的低强度散射光。因此，会出现展宽的峰，同时数据的可信度降低。团聚随着浓度的增加而增强，因此，DLS仅在稀释浓度下（通常为50−100μg/ml50-100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}）可靠，这使其不适用于许多使用更高浓度（高达几 mg/ml\mathrm{mg} / \mathrm{ml}）的治疗制剂[79]。

2.3.5. NPs的形状

NPs通常不是球形的，例如纳米星[80]、纳米管[81]。对于这类NPs，DLS提供一个RHR_H，根据定义，这是在分散体中以与非球形NPs相同速度运动的假设硬球体的半径。在最近的一篇论文中，Nair等人[82]修改了斯托克斯-爱因斯坦方程，以拟合从圆柱形结构（例如，纳米管）获得的数据：

Dt=kBT3πη L[ln⁡(Ld)+0.32]\begin{equation*} D_{t}=\frac{k_{B} T}{3 \pi \eta \mathrm{~L}}\left[\ln \left(\frac{L}{d}\right)+0.32\right] \tag{6} \end{equation*}

其中kBk_B = 玻尔兹曼常数（1.38064852×10−23 J/K1.38064852 \times 10-^{23} \mathrm{~J} / \mathrm{K}），TT = 温度，η\eta = 绝对粘度，LL = 圆柱体长度，dd = 圆柱体直径。纳米管的长径比（L/d）是已知的，因此这类圆柱形纳米材料的DtD_t也可以通过DLS确定。

2.3.6. NPs的转动扩散

在DLS中，通常测定的是平动扩散系数（DtD_t），而转动扩散系数（DrD_r）通常未被检测到，因为分散的颗粒旋转极快。然而，对于某些颗粒（例如，胶体金、较大且结晶的NPs），由于颗粒的转动扩散，可能会在较小尺寸（0−10 nm0-10 \mathrm{~nm}）处出现强度峰[83]。识别这些峰最简单的方法是在90∘90^{\circ}和173∘173^{\circ}散射角下对同一样品进行DLS光谱比较。与平动扩散不同，由颗粒旋转引起的光散射与角度无关，因此不会观察到由于转动扩散引起的峰位移。相反，由于平动扩散引起的峰在不同散射角下会发生位移。

2.3.7. 与比色皿相关的问题

对于含有有机溶剂的样品或需要温度≥50∘C\geq 50^{\circ} \mathrm{C}的实验，应避免使用塑料比色皿。特别是对于玻璃比色皿，当照亮区域靠近其壁面时——一部分从壁面反射的激光可能会被探测器记录为高强度光。这被称为“眩光”，通常表现为在1−10μm1-10 \mu \mathrm{m}处的尖锐峰。为避免眩光，应使用聚焦透镜将照亮区域移向比色皿的中间。

2.3.8. 仪器的维护

为从DLS获得持续的高质量数据，需要对仪器进行适当的维护。开启仪器后应至少静置30分钟，以给激光器足够的时间来稳定。根据NIST（美国国家标准与技术研究院）发布的指南[84]，应定期使用具有精确已知尺寸和极低PDI的参考NPs检查仪器。细胞色素C或BSA（牛血清白蛋白）以及不同尺寸的乳胶珠（例如100 nm）可分别用作尺寸≤20 nm\leq 20 \mathrm{~nm}和≥20 nm\geq 20 \mathrm{~nm}的参考。仪器 应能显示参考样品的尺寸偏差在2%以内。不同尺寸的胶体金也可用作参考材料。

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2.4. 实用性

2.4.1. DLS的分辨率

DLS的一个固有弱点是其分辨率低[85]。例如，DLS无法区分90 nm和110 nm的颗粒，会出现一个具有高PDI的宽峰。为了提供峰分辨率，DLS要求颗粒尺寸至少相差3倍（例如，10 nm和30 nm，50 nm和150 nm）[86]。这是DLS的一个局限性，尤其对于多分散样品。为了提高分辨率，可以事先对颗粒进行尺寸分离[87]。最新的DLS仪器可以与分析仪器联用，从而使DLS能够精确测定每个组分的尺寸。

2.4.2. 基于强度、体积或数量表示RHR_H

研究人员面临的一个常见难题是如何表达粒径，因为目前大多数DLS软件都提供了基于强度、数量和体积来表示粒径分布的选项。基于这三个参数表达数据通常会产生三种不同的RHR_H和粒径分布。DLS的原理是基于测量散射光的强度，因此，代表性的RHR_H值应始终从强度测量中推导出来，而另外两个参数（体积和数量）应仅作为辅助信息使用。

2.4.3. 向软件输入正确信息的重要性

像Zetasizer®这样的软件需要输入关于分散介质（例如，RI、粘度）和分散相（例如，RI、吸收）的数据。对于瑞利散射体（≤ 100 nm），这些信息通常不是必需的。然而，对于大于100 nm的颗粒——这在纳米颗粒药物递送系统中很常见——这些信息变得至关重要。在这种情况下，准确了解样品的RI和粘度是必不可少的，可以分别通过使用折射仪和流变仪获得。很难预测NPs如何改变样品的粘度。作为一个工作指南，可以说，如果单位体积分散介质中的NPs数量随着浓度的增加而增加，那么通常也会增加分散体的粘度[88]。了解分散介质的这些参数并相应地指导软件以避免错误数据至关重要。图5展示了一个例子，其中对在25∘C25^{\circ} \mathrm{C}下分散于水中（100μg/ml100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}）的稳定且高度单分散的羧化乳胶珠（约100 nm）进行了DLS测试，但分析时却设置为不同的分散介质（40%蔗糖、水、甲醇和甲苯）。令人惊讶的是，同一样品中颗粒的z-平均尺寸从约15 nm（40%蔗糖）急剧变化到约155 nm（甲苯），显示了DLS数据对这些输入的依赖性有多大。

2.4.4. DLS数据的正确报告

NIST发布了以下关于报告DLS数据的说明[84]： “至少应报告平均z-平均直径（或半径）和平均多分散指数，以及它们基于3到10次重复测量的标准差。重复测量的次数也应报告。如果应用了粒径分布分析算法，则应指明该算法以及分析中使用的任何关键参数值。其他应报告的关键信息包括：颗粒浓度（基于质量或体积）、分散介质组成、颗粒和分散介质的折射率值、介质的粘度值、测量温度、分析前用于去除外来颗粒物/灰尘的过滤或其他程序（包括孔径和过滤器类型）、比色皿类型和尺寸（光程）、仪器品牌和型号、散射角、以及激光波长。附加

图5. 在25∘C25^{\circ} \mathrm{C}下，使用Zetasizer®软件对同一份浓度为100μg/ml100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}的市售羧化乳胶珠（平均尺寸约100 nm）水分散液进行的基于强度的DLS数据，但选择了四种具有不同粘度和RI的溶剂（40%蔗糖、水、甲醇和甲苯）进行设置。z-平均尺寸根据溶剂的不同，从15 nm到153 nm不等。

的有帮助的信息包括：测得的自相关y轴截距（振幅）、测量期间的平均计数率、单次测量的持续时间以及平均信噪比。”

因此，需要提供关于如何进行DLS测量的详尽信息，以确保质量和可重复性。不幸的是，药物递送文献中报告的DLS数据很少达到如此高的标准，这个问题需要紧急解决。

2.4.5. DLS与其他粒径测量技术的比较

2.4.5.1

5.1. TEM（透射电子显微镜）。不同形式的电子显微镜（EM）[89]，例如TEM[90]，在NPs成像方面非常流行。借助图像分析软件（例如，ImageJ®），现在可以从TEM图像中获得NPs的粒径分布，并提供平均尺寸、标准差和PDI的总体估计。然而，来自TEM图像的此类信息通常与从DLS获得的数据不符，因为后者是基于强度的技术[91]，而TEM是基于数量的技术[92]，这使得它们在根本上有所不同。DLS的样品是溶剂化的，而TEM在超高真空（UHV）条件下对干燥样品进行操作[93]。DLS测量的是分散颗粒的RHR_H，而TEM提供的是基于穿透样品的电子量得出的投影表面积。因此，通过DLS获得的尺寸通常比TEM大。DLS的一个优势是它能够测量更大数量的颗粒（数百万），而TEM只能测量几百个。因此，DLS提供了更可靠的粒径分布和PDI数据。

2.4.5.2

5.2. NTA®（纳米颗粒跟踪分析）。随着Malvern公司Nanosight®系列仪器的推出，使用NTA®软件来测定粒径的方法迅速增多[94]。这两种技术都通过斯托克斯-爱因斯坦方程从DtD_t（本综述第2.1.2.2节）确定粒径。然而，它们确定DtD_t的方式不同，因此这两种技术获得的尺寸通常不相同。NTA®通过CCD相机捕捉散射光的视频来记录NPs的迁移率，从而检测DtD_t，而DLS则通过关联散射光强度 随时间的变化来检测它。为了比较这两种技术，提出以下几点[39]：（i）DLS所需的样品中颗粒密度（108−1012/ml10^8-10^{12}/\mathrm{ml}）通常高于NTA®（107−109/ml10^7-10^9/\mathrm{ml}）；（ii）对于同一样品，通过DLS获得的尺寸通常较小，但误差比NTA®大；（iii）NTA®在分析多分散样品方面比DLS更有效。NTA®的数据分析报告在3D空间中绘制颗粒尺寸，而DLS的报告是2D的。因此，NTA®提供更好的分辨率，并且比DLS更不容易受到来自较大颗粒的高强度散射的影响；（iv）虽然两种技术都能够分析亚微米颗粒，但DLS更能检测<30 nm的尺寸。总的来说，NTA®为处理特别是肽和大分子的治疗性纳米制剂提供了更好的分析套件。然而，它缺乏DLS的简便性，更昂贵，需要大量的样品制备和培训。

2.4.5.3

5.3. AFM（原子力显微镜）。AFM已成为一种有效的NPs成像工具，尤其是因为它能够在富含水的生物样品上工作[95,96]。AFM提供关于粒径和形状的精确信息，同时也能识别混合物中不同尺寸的颗粒。然而，AFM分析的颗粒数量要少得多，因此DLS能提供更好的粒径分布和PDI。

2.4.5.4

5.4. 通过沉降法测定粒径（X射线圆盘离心机和DCS/差示离心沉降法）。最近，基于沉降技术测定NP尺寸的方法越来越受欢迎（例如，包封药物、病毒、脂质体、乳液），尽管这些技术的原理早已为人所知。对这些技术的详细讨论和深入分析超出了本综述的范围，但有优秀的文献资料和技术说明可供参考[97-99]。简而言之，这些技术利用高离心力根据密度分级沉积NPs。NPs的尺寸测定是通过监测颗粒在旋转圆盘上的沉积，可以利用X射线吸收（X射线圆盘离心机）或单色光λ=400−500 nm\lambda=400-500 \mathrm{~nm}（DCS）。这些技术的数学算子是斯托克斯定律（公式（7））：

V=d2g(ρp−ρf)18η\begin{equation*} V=\frac{d^{2} g\left(\rho_{p}-\rho_{f}\right)}{18 \eta} \tag{7} \end{equation*}

其中VV = 速度（沉降速率），dd = 颗粒直径（cm），gg = 重力加速度（981 cm/s2981 \mathrm{~cm} / \mathrm{s}^{2}），ρp\rho_p = 颗粒密度（g/ml），ρf\rho_f = 流体/分散剂密度（g/ml），η\eta = 粘度（泊）。

这种基于沉降技术的粒径测定方法相比DLS具有某些优势：（i）它们能产生准确且高度可重复的数据，峰分辨率极佳（约2%），这是DLS无法实现的；（ii）这些工具可以操作的颗粒尺寸范围非常宽（2 nm−80μm2 \mathrm{~nm}-80 \mu \mathrm{m}），而DLS的操作尺寸检测窗口仅为10−200 nm10-200 \mathrm{~nm}；（iii）用这些技术测得的颗粒尺寸与SEM/TEM数据相当，而DLS测得的尺寸几乎总是大于SEM/TEM；（iv）这些技术提供多模式尺寸测定，具有高通量模式，可以同时运行约40个体积为100μl100 \mu \mathrm{l}的样品。

认识到沉降技术是根据密度来确定NPs尺寸的，这一点至关重要。因此，只要密度相同，DCS就无法区分两种不同的NPs。例如，对于由相同材料制成的较小的实心颗粒和较大的多孔颗粒，如果它们的密度相同，DCS可能会得出相同的尺寸。对于非球形颗粒，DCS的执行也可能比较困难，并且通常提供比实际测量值小的尺寸（斯托克斯等效直径）。例如，已知长径比为2和3的棒状颗粒产生的尺寸分别比实际测量值小5%和10%。对于密度低于分散剂的颗粒，DCS也很难操作，因为它们有漂浮的趋势。然而，随着当前仪器的进步，这些挑战通常都能得到解决。不过，DCS需要更大的样品体积（100μl100 \mu \mathrm{l}），而现代DLS仪器可以在低至12μl12 \mu \mathrm{l}的体积下操作。此外，像Malvern Zetasizer®这样的紧凑型仪器可以同时测量颗粒（流体动力学）尺寸和Zeta电位，而这在DCS中是不可能的。

2.4.5.5

5.5. 通过激光衍射测定粒径。激光衍射是测定NPs尺寸的一种有效工具，其核心原理与DLS一样，也是基于光散射[100]。颗粒以一种与尺寸相关的方式散射光，即较大颗粒在较小角度散射得更强烈，而较小颗粒在较宽角度散射得较弱。在激光衍射技术中，光散射表示为散射角的函数，这反过来又用于测量粒径。

与DLS的主要区别在于：（i）激光衍射技术确定的是一个颗粒的尺寸，该颗粒的光散射方式与被研究颗粒相似。相反，DLS测量的是一个假设的实心颗粒的（流体动力学）半径，该颗粒在分散体中扩散时，散射光的强度与被研究颗粒相同。因此，通过这些技术获得的结果并不相同，并且通常相差10-20%，具体取决于实验条件和NPs的类型；（ii）DLS的检测下限更小，而激光衍射的检测上限更大。因此，对于较小的NPs（例如，≤50 nm\leq 50 \mathrm{~nm}），DLS提供更好的数据，而对于较大的颗粒（例如，≥1μ m\geq 1 \mu \mathrm{~m}），激光衍射更合适；（iii）DLS需要的样品体积要少得多（以µl计），而激光衍射需要更大的体积（以ml计）；（iv）激光衍射更适用于含有较大尺寸颗粒杂质的样品。总的来说，激光衍射为用于药物递送的纳米制剂提供了一个更好的尺寸测定工具，因为它们通常≥100 nm\geq 100 \mathrm{~nm}。然而，它不提供紧凑的尺寸和Zeta电位测定实验套件，因此，激光衍射技术不具备DLS的简便性。

2.4.6. 在细胞培养基中的DLS

在细胞培养基（例如DMEM、RPMI）中进行DLS可能很困难，因为它们含有各种小分子（例如，离子）和大分子（例如，维生素）。由于这些分子的吸附，NPs的表面性质和尺寸会发生变化。这在含有富含蛋白质的胎牛血清（FCS）的培养基中尤其明显。较大蛋白质分子的吸附可以 显示出分散的NPs的RHR_H急剧而迅速的增加[101,102]。NPs上的吸附层在组成上是动态的，因此RHR_H会随时间波动，然后才稳定下来。应使用不含pH指示剂（例如，酚红）的细胞培养基，因为有色物质会吸收激光并产生干扰。

2.4.7. 对气溶胶和泡沫的DLS

新型胶体制剂，如气溶胶、泡沫，在药物递送中越来越受欢迎。对这类样品进行DLS测量很困难，扫描迁移率粒径谱仪（SMPS）是这类制剂的首选技术。然而，文献中有报道使用DLS测量气溶胶和泡沫的粒径。例如[103]，在自制的光散射仪器中，在90∘90^{\circ}散射角下测量了燃烧香烟头产生的气溶胶化碳烟的尺寸。Durian等人（1991）也做了类似的尝试，他们使用光散射技术来确定泡沫的粒径以及内部动力学[104]。

好的，这是对您提供的文件中全部内容的完整、忠实且保留原格式的中文翻译。物理化学名词已加粗，图片引用保持原样。

3. Zeta电位 (ZP)

3.1. ZP的原理

ZP，也称为动电电位，是胶体颗粒在电场下移动时，其滑动面/剪切面处的电位[105]。表面的电位是指将一个单位正电荷从无穷远处无加速度地移动到该表面所需要做的功。ZP反映了具有电泳迁移能力的颗粒的双电层（EDL）与周围分散介质层在滑动面上的电位差。

3.1.1. 理解EDL和滑动面

当一个带电颗粒被分散时，其表面会形成一个吸附的双层，通常称为EDL[106]（图6）。内层主要由与颗粒电荷相反的离子/分子组成（斯特恩层）。在斯特恩层之外，由颗粒表面电荷产生的静电效应根据德拜定律减弱——该定律指出，每经过一个德拜长度的距离，电场强度会减小一个因子 1/e1/e [107]。

虽然在数学上这种静电效应延伸至无穷远，但在实验中它仅存在于距离颗粒表面几纳米的范围内。由于带电NPs的静电场，在斯特恩层之外会形成一个由相同和相反电荷的离子/分子组成的扩散层，该扩散层与斯特恩层共同构成了EDL。这个扩散层的组成是动态的，并根据多种因素（如pH、离子强度、浓度等）而变化。当对这样的分散体施加电场时，带电颗粒会向相反的电极移动（电泳）。在这个扩散层中，存在一个假设的平面，它在电泳过程中充当移动颗粒与周围分散介质层之间的界面。这个平面就是特征性的滑动面/剪切面，而ZP就是这个颗粒-流体界面上的电位。在描述它时，数学方程中最初使用了希腊字母ζ\zeta（zeta），因此得名Zeta电位。颗粒表面本身的电位被称为能斯特电位（ψ0\psi_0）[108]，并且无法测量。在分散体中，静电场随距离颗粒表面的增加而减弱，如公式（8）所示：

ψ=ψde−κx\begin{equation*} \psi=\psi_{d} e^{-\kappa x} \tag{8} \end{equation*}

其中ψ\psi = 距离斯特恩层x处的表面电位，ψd\psi_d = 斯特恩层处的表面电位，κ\kappa = 德拜-休克尔参数，xx = 距离。

当滑动面非常靠近斯特恩层时，ψd≈ζ\psi_{\mathrm{d}} \approx \zeta，因此，公式（8）可以修改为公式（9）：

ψ=ζe−kx\begin{equation*} \psi=\zeta e^{-\mathrm{kx}} \tag{9} \end{equation*}

图6. 显示带负电颗粒上EDL的卡通图。紧贴颗粒表面的是一个牢固附着的层（斯特恩层），由相反电荷的离子组成，即本例中的正离子。斯特恩层之外形成一个扩散层，包含正负两种电荷。在电泳过程中，带有吸附EDL的颗粒向电极（本例中为正电极）移动，滑动面成为移动颗粒和分散剂之间的界面。ZP是该滑动面上的动电电位。

κ\kappa（德拜-休克尔参数）取决于离子强度。因此，随着离子存在的增加（例如，添加电解质），双电层被压缩，ZP降低。

3.1.2. 测量ZP时的基本数学算符

ZP不能直接测量，而是从带电颗粒在施加电场下的电泳迁移率推导出来的。颗粒的电泳迁移率（μe\mu_e）首先计算如下（公式（10））：

μe=VE\begin{equation*} \mu_{e}=\frac{V}{E} \tag{10} \end{equation*}

其中VV = 颗粒速度（μm/s\mu \mathrm{m} / \mathrm{s}），EE = 电场强度（Volt/cm）——两者均为已知量。然后通过亨利方程（公式（11））从得到的μe\mu_e计算ZP：

μe=2εrε0ζf(Ka)3η\begin{equation*} \mu_{e}=\frac{2 \varepsilon_{r} \varepsilon_{0} \zeta \mathrm{f}(K a)}{3 \eta} \tag{11} \end{equation*}

其中εr\varepsilon_r = 相对介电常数，ε0\varepsilon_0 = 真空介电常数，ζ\zeta = ZP，f(Ka)f(Ka) = 亨利函数，η\eta = 实验温度下的粘度。

当EDL的厚度远小于颗粒半径时——这可能是由于在高盐浓度（10−2M10^{-2} \mathrm{M}）水溶液中的较大颗粒（高达1μm1 \mu \mathrm{m}）所致——f(Ka)f(Ka)的值取为1.5，亨利方程则修改为亥姆霍兹-斯莫卢霍夫斯基（HS）方程（公式（12））：

μe=εrε0ζη\begin{equation*} \mu_{e}=\frac{\varepsilon_{r} \varepsilon_{0} \zeta}{\eta} \tag{12} \end{equation*}

HS方程适用于大多数药物制剂，因此对于开发纳米药物递送系统非常重要[109]。

相反，当由于较小（≤100 nm\leq 100 \mathrm{~nm}）的颗粒分散在低盐浓度 （10−5M10^{-5} \mathrm{M}）中，EDL的厚度远大于颗粒本身时，f(Ka)f(Ka)的值取为1，亨利方程可以修改为休克尔方程（公式（13））：

μe=2εrε0ζ3η\begin{equation*} \mu_{e}=\frac{2 \varepsilon_{r} \varepsilon_{0} \zeta}{3 \eta} \tag{13} \end{equation*}

休克尔方程通常与药物制剂无关，因为它不适用于水分散体，尽管它在陶瓷工业中很受欢迎。

3.2. ZP测量的仪器

施加电场，然后通过以下两种方式测量颗粒的电泳迁移率： a) 电泳光散射：在电泳过程中，移动的颗粒散射入射激光。由于颗粒是移动的，散射光的频率与原始激光不同，频率偏移与颗粒的速度成正比（多普勒频移）。用于该技术的仪器如图7所示。简而言之，激光束被分成两束，一束射向样品，另一束用作参考光束。来自样品的散射光与参考光束组合或光学混合以确定多普勒频移。颗粒速度的大小（VV）从多普勒频移推导出来，然后通过公式（10）-（13）所列的一系列数学方程测量ZP。该技术常与DLS结合使用，因此出现了一系列提供DLS和ZP集成测量套件的仪器（例如，Malvern Zetasizer®），这些仪器在大学毕业生和纳米制剂研究组中很受欢迎。Zetasizer®系列仪器在此类应用中使用先进的激光干涉M3-PALS（相位分析光散射）技术[110]。可使用带有内置镀金铜电极和可容纳0.75 ml样品的弯曲毛细管的一次性塑料（聚碳酸酯）比色皿，在一次运行中同时进行DLS和ZP测量。与DLS一样，Zetasizer®软件界面允许用户开发定制的SOPs并输入相关信息。

图7. 显示通过电泳光散射测量ZP的仪器示意图。

b) 电声现象：在该技术中，施加高频电场，使样品中的颗粒振荡，其振荡取决于它们的尺寸和ZP。通过分析振荡的幅度和相角来确定粒径和ZP[111]。该技术在药物递送研究中不太常用。

3.3. ZP数据的解读

3.3.1. 影响ZP的因素

3.3.1.1

1.1. pH。pH可能是ZP测量中影响最大的参数，尤其是在水分散体中，这使其与药物制剂相关。ZP随pH变化，在酸性和碱性pH下，其绝对值分别变得更正和更负[112]。因此，通常会生成ZP对不同pH值的滴定曲线，这有助于确定等电点，即ZP变为零的pH值[113]。对于水分散体——其中H+\mathrm{H}^{+}和OH−\mathrm{OH}^{-}是主要的离子成分——等电点也表示零电荷点（PZC）[114]。当pH接近等电点时，胶体失去稳定性并发生团聚/絮凝。

3.3.1.2

1.2. 离子强度。随着离子强度的增加，EDL变得更加压缩，而ZP降低，反之亦然。在测量ZP时，离子的价态也很重要。对于价态较高的离子（例如，Ca2+,Al3+\mathrm{Ca}^{2+}, \mathrm{Al}^{3+}比单价的Na+,H+,OH−\mathrm{Na}^{+}, \mathrm{H}^{+}, \mathrm{OH}^{-}价态更高），EDL变得更紧凑，ZP的绝对值降低。

3.3.1.3

1.3. 浓度。ZP与颗粒浓度之间的关系很复杂，通常由表面吸附和EDL效应共同决定。很难就浓度对ZP的影响提供一个通用指南。然而，可以说，在稀释条件下，表面吸附现象占主导地位，因此ZP随浓度增加而增加。然而，在较高 浓度范围内，EDL的厚度占主导地位，此时增加浓度会产生相反的效果，即ZP降低，分散体的稳定性减弱[115]。

3.3.2. ZP与胶体稳定性

ZP数据最常见的用途之一是将其与胶体稳定性联系起来。在药物递送文献中，通常将ZP值为±0−10mV,±10−20mV\pm 0- 10 \mathrm{mV}, \pm 10-20 \mathrm{mV}和±20−30mV\pm 20-30 \mathrm{mV}以及>±30mV^{>} \pm 30 \mathrm{mV}的NP分散体分别归类为高度不稳定、相对稳定、中度稳定和高度稳定[116]。然而不幸的是，现实情况比这复杂得多。尽管ZP确实提供了关于胶体稳定性的指示，但它并不能反映全貌。根据最广为接受的DLVO（以发明者Derjaguin, Landau, Verwey和Overbeek的名字命名）理论，胶体稳定性取决于范德华吸引力和由于EDL产生的静电排斥力之和[117]。虽然ZP提供了关于静电排斥力的信息，但它没有提供任何关于范德华吸引力的见解。因此，遇到具有低ZP的稳定胶体或反之亦然的情况并不少见。理解自然界中这类吸引力（如范德华力）涉及大量理论，超出了本综述的范围。需要注意的一个重点是，范德华吸引力取决于哈梅克常数[118]，该常数间接对应于颗粒和分散介质的RI之差。因此，如果哈梅克常数较低，范德华吸引力也会变弱，此时由低ZP（例如10-15 mV）反映的温和静电排斥可能就足以确保胶体稳定性。像胶体二氧化硅这样的材料在非常低的ZP下也表现出优异的稳定性[119]。应当指出，位阻相互作用也可以促进胶体稳定性。例如，一些油包水乳液尽管ZP较低，但仍高度稳定[120]。众所周知，PEG化也能在降低ZP的同时促进NPs的稳定性[121]。

3.3.3. ZP与NPs的表面电荷

ZP另一个广泛流行的用途是评估NPs的表面电荷。ZP的正负维度是通过在电泳过程中识别颗粒向哪个电极移动来确定的。应该注意的是，ZP从不测量电荷或 电荷密度，而是处理表面电位。因此，只有ZP的绝对值是重要的，而与其相关的正/负结果并不稳健，不应与表面电荷或电荷密度相关联，也不应用于在不同纳米制剂之间进行比较。如本综述前面部分所述，多种因素（例如，与纳米制剂相关的pH）可以使其从+ve变为-ve，反之亦然。ZP仅提供关于表面电荷性质（正/负）的指示性证据，前提是假设在EDL中直至滑动面的主要离子与颗粒表面本身的离子性质相似（正/负）。不幸的是，这种假设有太多的例外。确认性质（正/负）以及确定NPs上电荷密度的实用方法是用已知量的离子进行滴定。这种滴定技术的详细描述超出了本文的范围，但有优秀的参考文献可供查阅[122,123]。

颗粒-分散介质界面（例如滑动面）上的电荷是一个复杂且了解较少的现象。通常，几乎所有自然存在的表面和分子都表现出负电荷（例如，细胞膜、蛋白质、脂质、粘液等）。相反，阳离子表面和分子通常是合成的。基于ZP声称拥有“中性”NPs也是不合适的，因为在分散体中永远不会有中性的NPs，因为它们表面不可避免地会积聚电荷。一个有趣的事实是，NPs上的表面电荷实际上可以根据胶体内不同相而变化。根据科恩法则，如果溶质和溶剂都是绝缘体，那么相对介电常数（εr\varepsilon_{\mathrm{r}}）较高的一方在界面处会带正电。因此，在室温下，二氧化硅（εr=3.9\varepsilon_{\mathrm{r}}=3.9）NPs在水（εr=80\varepsilon_{\mathrm{r}}=80）中带负电，但在苯（εr=2.27\varepsilon_{\mathrm{r}}=2.27）中带正电。

3.4. 实用性

3.4.1. 参考材料

与DLS不同，ZP没有参考或标准材料，这在实际操作中很不方便。NIST建议使用针铁矿（α−FeO(OH)\alpha-\mathrm{FeO}(\mathrm{OH})），在特定条件下制备后，应能提供+(32.5±0.12)mV+(32.5 \pm 0.12) \mathrm{mV}的ZP值[124]。然而，每次都需要重新制备样品，而且可能会污染比色皿。基于不同仪器的数据也可能出现轻微差异。

3.4.2. 测量ZP后重复使用样品

电泳可能会降解一些NPs，因此，测量ZP后的样品可能不适合重复使用。作为一般指南，可以说，如果可能，应避免在测量ZP后重复使用样品进行实验。如果情况并非如此（例如，由于样品体积小），那么在测量ZP后，应对颗粒进行充分的重新表征，包括DLS和凝胶电泳，以排除在施加电压下颗粒的任何降解。

3.4.3. 使用含金属离子的缓冲液

用于ZP测量的样品池中的电极容易发生反应，尤其是与金属离子（例如，Fe3+\mathrm{Fe}^{3+}）[125]。这种反应会损坏电极并影响数据质量。因此，建议定期检查电极。如果在存在有害反应的情况下，电极与离子之间的接触无法避免，则可以使用扩散屏障法[126]，在该方法中，仍然可以测量颗粒的电泳迁移率，同时防止电极与缓冲液之间的任何接触。然而，这需要额外的专业知识。

3.4.4. 在细胞培养基中测量ZP

在细胞培养基中测量ZP可能具有挑战性。细胞培养基富含大量离子，具有非常高的电导率，并干扰ZP测量。如此高的电导率在恒定电压下会产生足够的热量，可能会降解 样品。在低电压下使用较高浓度的NPs（5−10mg/ml5-10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}）可能有助于获得稳定的ZP读数。不幸的是，在含有大量蛋白质的胎牛血清（FCS）的细胞培养基中，情况变得更加复杂。可用的蛋白质分子会吸附在NP表面，并影响分散性和ZP[127]。蛋白质分子有时也会形成小的纳米团聚体，这会干扰读数并可能产生额外的异常峰。

4. 讨论

DLS和ZP的基本原理都根植于物理胶体化学领域，为了理解它们的应用方面，必须牢牢掌握其核心物理和数学原理。大多数大学的本科生物理化学课程中已经教授了DLS和ZP的基础知识。然而不幸的是，在药物递送研究组中，通常缺乏对进行DLS和ZP操作的年轻研究人员的类似培训和结构化培养过程。这一知识上的差距以及缺乏适当培训的问题需要得到解决。

DLS和ZP测量都基于光散射，因此只有澄清的样品才能用于这两种技术。此外，这两种技术都无法处理浓缩样品。举例来说，作为基于光散射的粒径测量支柱的斯托克斯-爱因斯坦方程，在数学上仅在无限稀释的浓度下才可行。实际上，通常使用50−100μg/ml50-100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}的浓度。不幸的是，这与治疗相关剂量几乎没有关联，后者的浓度要高得多，并且其中常常存在>200 nm的颗粒。结果，制备的纳米制剂样品通常既不够澄清也不够稀释，不适合进行DLS和ZP测量。需要强调的是，DLS和ZP有其自身的局限性，它们无法处理高浓度是这两种技术的主要弱点。表面化学在测量DLS和ZP中很重要，颗粒表面的任何变化都会改变结果。在含有复杂工程化纳米结构的高浓度治疗相关样品中，许多参数（例如，粘度、pH、介电常数、RI等）都会发生变化，因此用于DLS和ZP测量的稀释样品绝不能充分代表将在体内使用的治疗制剂。因此，DLS和ZP的结果不应成为将纳米制剂仓促用于体内研究的依据。DLS和ZP大多在具有已知离子强度和pH值、受控实验室环境下的水分散剂中进行，这与体内环境几乎没有可比性，因为体内的分散介质通常是具有复杂基质的血液。DLS和ZP既不能在血液中操作，也不能预测NPs在血液中的行为。这两种技术最初是为蛋白质分散体开发的，虽然它们在某些操作条件下对工程化NPs效果良好，但它们在表征体内****纳米制剂方面的范围是有限的。

然而不幸的是，在现阶段，缺乏能够处理复杂生物基质（例如血液）的适当分析工具，当前的研究工作重点应紧急解决这个问题，以促进转化。在过去几年中，出现了各种各样的纳米制剂，但它们的转化影响总体上令人失望，体外-体内相关性很差[128-130]。在生理相关条件下表征NPs存在挑战。DLS和ZP是在NPs开发的初始阶段对其进行表征的优秀工具。然而，在纳米制剂制备的后续阶段，或为体内相关性提供可靠数据方面，这两种技术的范围变得越来越有限。

利益冲突

作者声明不存在任何利益冲突。

致谢

UCD提供了资金和科学文献的获取途径。作者要感谢他的同事和学生们进行的无数次讨论，这些讨论为本综述奠定了基础。感谢UCD化学学院的Dermot Brougham博士和Delyan Hristov博士分别进行的启发性讨论和提供的乳胶珠。

附录A. 补充数据

本文的补充数据可在 http://dx.doi.org/10.1016/j.jconrel.2016.06.017 在线找到。